Лабораторная диагностика коклюша имеет особое значение, так как клиническое распознавание этого заболевания может быть затруднительным. В настоящее время она является важным элементом противоэпидемических мероприятий. Только на основе выделения возбудителя можно точно определить, страдает ли пациент коклюшем или паракоклюшем.
Лабораторные исследования проводятся как с диагностической целью (для детей, которые кашляют более 7 дней или имеют подозрение на коклюш по клиническим признакам), так и по эпидемическим показаниям (для лиц, контактировавших с больным).
Лабораторная диагностика коклюшной инфекции проводится в двух направлениях: прямое обнаружение возбудителя или его антигенов/генов и выявление специфических антител к коклюшной палочке или ее антигенам в биологических жидкостях пациента (сыворотке крови, слюне, секретах носоглотки). Количество этих антител обычно увеличивается в динамике заболевания.
К группе «прямых» методов относятся бактериологический метод и экспресс-диагностика. Бактериологический метод считается золотым стандартом, так как позволяет выделить культуру возбудителя на питательной среде и идентифицировать его до вида. Однако он успешен только в ранние сроки заболевания – первые 2 недели. Его чувствительность крайне низка, так как с начала второй недели выделяемость возбудителя падает, а подтверждаемость диагноза составляет всего 6-20%. Это связано с прихотливостью B. pertussis, медленным ростом на питательных средах и их недостаточным качеством, а также использованием антибиотиков в качестве селективного фактора. Кроме того, бактериологическое выделение возбудителя требует длительного времени – до 7 суток до выдачи окончательного ответа.
Другим существенным недостатком метода является его низкая чувствительность. Экспресс-методы позволяют обнаружить гены/антигены B. pertussis непосредственно в исследуемом материале, используя молекулярно-генетические (ПЦР) и иммунологические (РИФ, ИФА, микролатекс-агглютинация) методы. ПЦР является высокочувствительным и специфичным методом, который может быть использован на разных сроках заболевания, даже на фоне приема антибиотиков. Однако, этот метод пока не может быть внедрен в практику базовых лабораторий.
Таким образом, лабораторная диагностика коклюша остается сложной задачей, но с помощью современных методов можно достичь высокой точности и быстроты результатов.
Прямые методы, которые применяются для экспресс-диагностики, могут быть также использованы при идентификации B. pertussis в чистых культурах, включая материал из изолированных колоний, в процессе бактериологического исследования.
К методам, направленным на выявление противококлюшных антител, относятся серодиагностика, основанная на определении антител в сыворотках крови, и методики, которые позволяют регистрировать специфические антитела в других биологических жидкостях (слюне, секретах носоглотки).
Серодиагностика может быть применена на более поздних сроках, начиная со второй недели заболевания. При наличии типичных клинических проявлений коклюша она может лишь подтвердить диагноз, но при стертых и атипичных формах, которые в настоящее время встречаются гораздо чаще, и когда результаты бактериологического метода обычно отрицательны, серодиагностика может оказаться решающим фактором в выявлении заболевания.
Проводимое лечение антибактериальными препаратами не влияет на результаты этого метода.
Обязательным условием является исследование «парных» сывороток больных, взятых с интервалом не менее двух недель. Диагностически значимой является выраженная сероконверсия, то есть увеличение или уменьшение в четыре раза и более уровня специфических антител.
Однократное обнаружение специфических к B. pertussis IgM и/или IgA и/или IgG в ИФА или антител в титре 1/80 и выше в реакции агглютинации (РА) у не привитых и не болевших коклюшем детей до года и у взрослых при обнаружении у них специфических IgM методом ИФА или при обнаружении антител к B. parapertussis в титре не менее 1/80 методом РА является допустимым.
В литературе описано три типа реакций, которые можно использовать для этой цели: РА, реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) и ИФА. Однако следует учитывать, что для постановки РПГА не существует стандартных промышленных иммунологических тест-систем, а тест-системы на основе ИФА, позволяющие регистрировать количество сывороточных иммуноглобулинов классов G, M и секреторных А к отдельным антигенам B. pertussis, не выпускаются в России, а зарубежные тест-системы имеют высокую стоимость.
РА, несмотря на сравнительно невысокую чувствительность, является единственной доступной реакцией для любых российских лабораторий, позволяющей получить стандартизированные результаты, поскольку для ее постановки выпускаются коммерческие коклюшные (паракоклюшные) диагностикумы российской промышленностью.
В связи с вышесказанным, в современных условиях на территории РФ для медицинских учреждений, предоставляющих диагностические услуги населению на бюджетной основе, приняты следующие методы диагностики коклюша, регламентированные нормативными документами: основные – бактериологический и серодиагностика, и рекомендуемый – ПЦР.
Культуральный метод (рост В. pertussis на питательной среде):
- наиболее специфичный тест на коклюш;
- лучше всего проводить на ранних стадиях заболевания;
- требовательность В. pertussis к питательной среде затрудняет выделение микроорганизма;
- может занимать до 2 недель.
ПЦР (обнаружение ДНК В. pertussis в образце):
- наиболее часто используемый тест;
- быстрый;
- высокая чувствительность;
- возможны ложноположительные результаты;
- более низкая точность после 4 недель кашля.
Серология (обнаружение антител и B. pertussis в крови):
- может подтвердить заболевание на позднем этапе инфекции (2–12 недель после начала кашля);
- клиническая точность многих тестов различного производства не доказана или неизвестна;
- не подходит для детей в возрасте до 3 месяцев.
При подозрении на коклюш требуется быстрая лабораторная диагностика, позволяющая на раннем этапе проводить адекватную антибактериальную терапию и принимать необходимые меры для предотвращения бактериальной передачи.
Скачать Коклюш, паротит методичка БГМУ 2022
Схема бактериологической диагностики коклюша состоит из четырех этапов:
I этап (1-й день):
1. Забор материала. Основной материал – слизь с задней стенки глотки, которая отбирается двумя способами: «заднеглоточными» тампонами (последовательно сухим, затем смоченным физиологическим раствором) и/или «носоглоточным» тампоном. Также используется метод «кашлевых пластинок» (только при диагностических исследованиях). Дополнительный материал – гортанно-глоточные смывы, промывные воды бронхов (при выполнении бронхоскопии) и мокрота.
2. Посев на пластинки Борде-Жангу с 20-30% крови или КУА, а также на бордетеллагар с добавлением селективного фактора цефалексина. Термостатирование при 35-36°С в течение 2-5 суток с ежедневным просмотром.
II этап (2-3-и сутки):
1. Отбор характерных колоний и отсев на сектора пластинки КУА или бордетеллагара для накопления чистой культуры. Термостатирование.
2. Изучение морфологических и тинкториальных свойств в мазке по Граму.
3. При наличии множества типичных колоний изучение антигенных свойств в слайд-агглютинации с поливалентной коклюшной и паракоклюшной сыворотками и выдача предварительного ответа.
III этап (4-5-е сутки):
1. Проверка чистоты накопленной культуры в мазках по Граму.
2. Изучение антигенных свойств в слайд-агглютинации с поливалентными коклюшной, паракоклюшной и адсорбированными факторными сыворотками 1, 2, 3 и 14. Выдача предварительного ответа.
3. Изучение биохимических свойств (уреазной и тирозиназной активности, способности утилизировать цитрат натрия).
4. Изучение подвижности и способности расти на простых средах.
IV этап (5-6-е сутки): учет дифференциальных тестов и выдача окончательного ответа по комплексу фенотипических и антигенных свойств.
В зависимости от наличия лабораторного подтверждения и других критериев существует следующая градация случаев коклюша:
— Эпидемиологически связанный случай – случай острого заболевания, отвечающий стандартному определению случая коклюша и имеющий эпидемиологическую связь с другими подозрительными или подтвержденными случаями.
— Вероятный случай – отвечает клиническому определению случая, но не подтвержден лабораторно и не имеет эпидемиологической связи с подтвержденным случаем.
— Подтвержденный случай – отвечает клиническому определению случая, подтвержден лабораторно и/или имеет эпидемиологическую связь с подтвержденным случаем.
Лабораторным подтверждением считается положительный результат хотя бы в одном из следующих методов: бактериологическое выделение культуры возбудителя (B. pertussis или B. parapertussis), обнаружение специфических фрагментов геномов этих микроорганизмов методом ПЦР, выявление специфических антител при серодиагностике.
Соответственно, подтверждается диагноз: коклюш, вызванный B. pertussis, или коклюш, вызванный B. parapertussis.
Лабораторно подтвержденный случай не обязательно должен отвечать стандартному клиническому определению случая (атипичные, стертые формы).